《厦门理工学院学报》  2020年第5期 47-52   出版日期:2020-10-30   ISSN:1673-4432   CN:35-1289/Z
便携式癌细胞荧光显微成像系统的设计与实现


随着荧光成像技术的发展,荧光显微技术已经成为一种新型生物光学显微技术,可以用来研究细胞内部物质的运动状态和化学物质的分布及定位等[1],因此荧光显微成像技术被广泛应用于医学检测领域,可以快速、准确地检测出人体病变细胞[2]。随着微流控和光电子技术的发展,国外市场化的激光诱导荧光分析仪器陆续推出[3],激光诱导荧光设备指标先进、性能稳定可靠,但都是通用型设备,设备体积比较大,价格昂贵,未见针对癌细胞检测的便携式设备。国内相关研究偏向于现有的激光诱导荧光检测设备如何更精确地、定性定量地检测出被测物,但是市场化的激光诱导荧光系统很少,更没有癌细胞细分领域的专业荧光检测设备[4]。 本研究采用新型超低噪声科学级面阵CMOS探测器,配合散斑抑制和高效率的二向色镜、LED光源模块和电路板,采用半数字式对焦技术、万兆网传输高分辨率图像,设计出针对人体癌细胞的便携式荧光显微成像系统。 1系统的设计 在深入研究系统集成、便携、光学设计、电子学、光谱分析等方面的基础上,通过荧光成像的机理研究,选择高效率的光学系统,配合微型高精度的半数字式对焦技术和高灵敏图像采集技术,实现高性能的荧光成像系统。设计出结构紧凑、高性能的便携式癌细胞荧光检测系统。系统主要由光学部分和电子学部分组成,荧光成像系统框架如图1所示。 图1荧光成像系统结构框图 Fig1Fluorescence imaging system block diagram 由图1可见,光学系统由光源模块(LED光源、散斑抑制器、扩束器)、二向色镜片、滤光片和成像镜头构成;电子学系统由成像相机和电路板组成。电路板包含采集控制电路、电机控制模块和万兆网通信。系统工作流程是:首先电路板发出指令到光源模块,LED光源发射激发光,经过均匀化和扩束后,通过二向色镜片反射在被测物体上。被测物体的分子吸收激发光光子而发生能级跃迁产生荧光发射[5]。FPGA电路板根据评价函数结果驱动陶瓷电机运动,带动物镜移动,实现对被测物纳米级别的自动聚焦,然后经过聚焦的光线通过二向色镜片投射到滤光轮,经过成像镜头在探测器上荧光成像并存储在电路板存储器中,最后通过万兆网将高清晰荧光图像传输到电脑端。 厦门理工学院学报2020年 第5期黄新栋,等:便携式癌细胞荧光显微成像系统的设计与实现 11光学部分设计 光学部分主要由光源模块、滤光片、透镜、物镜和成像镜头构成。由荧光的发光原理可知,待测物内部组织结构影响激发光照射到待测物产生的荧光波长,待测物内部成分含量决定荧光强度大小,因此不同细胞在吸收激发光时,在不同波段会激发出其荧光峰值,根据采集到的不同波段的荧光量值来判别不同细胞的存在。另外,激发光源的波长一般比荧光波长短。分子荧光光谱与激发光源的强度有直接关系,激发光源功率越大,荧光光谱越强[6]。因此选择激光光源的时候主要考虑光功率、光源是否适合便携式以及照明光源照射在被测物时拉曼散射光谱峰离开荧光光谱峰,便于光学系统将拉曼散射光谱滤除。系统采用二向色镜和窄带滤光片两类滤光片,在滤光片前端采用半数字式对焦技术聚焦癌细胞,提高设备性能。同时要实现微米级细胞的清晰成像,需要实现纳米级别的聚焦技术。 111光源 系统选用大功率LED灯作为光源,其具有寿命长、光毒性小、易于控制等诸多优点,并且系统主要用于观测癌细胞,癌细胞的荧光光谱与正常细胞具有明显特征区别,为了很好的观测癌细胞,选择绿色光、蓝色光、紫色光波段的LED光源。LED光源输出的光经过校正后存在散斑问题,这将直接影响最终的成像质量,所以采用散斑抑制器[7]将输出激光均匀化,同时利用扩束器将光斑扩束,扩束角度约7°。光源散斑抑制器和扩束器一体化示意图见图2。 图2光源散斑抑制及扩束一体化示意图 Fig2Light source speckle suppression and beam expansion 112滤光片 选用二向色镜和窄带滤光片两类滤光片。激发光照射到待测物,待测物产生发射光,窄带滤光片用来过滤除荧光之外的其他光信号[8]。二向色镜是激发光诱导荧光检测装置中的重要部件,对于不同波长光的选择性极强,对一定波长的光完全透过,而对其余波长的光完全反射,利用这一特点来分离荧光与激发光[9]。二向色镜的反射波长与激发光波长匹配,透射波长与癌细胞荧光发射波长匹配,对激发光光源的反射率和对荧光发射波长的透过率都达到95%以上。由于二向色镜的滤波作用不可能达到100%,产生的荧光信号中或多或少掺杂了一些背景干扰光(主要是来自光学器件反射或者散射的激发光),所以在收集荧光之前需要利用窄带滤光片进一步滤波。所用窄带滤光片,要与荧光特征峰的波长相匹配。系统中的窄带滤光片采用绿光、蓝光、紫光波段,半宽为10 nm,峰值透射率大于97%,将其置于探测器前端,可进一步提高信噪比。 12电子学部分设计 电子学系统包括了探测器模块、万兆网通信、电机控制模块和调焦电机。电子学的主要功能是采集传感器图像进行处理、显示和传输,采集到的图像进行清晰度计算并控制电机实现自动对焦,实现清晰图像的采集并缓存到板载内存中,然后通过万兆网将图像数据发送到电脑。同时显微镜留有数字视频(digital visual interface, DVI)显示接口,可直接连接显示器进行显示。电子学的硬件电路框架如图3所示。 图3电子学电路结构框图 Fig3Hardware circuit block diagram 核心的现场可编程门阵列(field programmable gate array, FPGA)芯片采用XILINX公司的Kintex7系列的XC7K420T芯片,具有高I/O带宽与高数字信号处理能力,能够高效进行图像处理,性能高,成本低,功耗低。DVI显示器采用DVI接口传输数字信号和数字图像,传输速度快,色彩更逼真。先入先出(first input first output, FIFO)数据缓冲器没有外部读写地址线,使用起来非常简单。 121探测器模块 荧光检测器中的光电转换元件要求有很高的灵敏度、很低的暗电流、很高的信噪比及较短的响应时间。目前大部分的荧光检测设备都采用了具有超快响应速度和极高灵敏度的光电倍增管。而在激发光诱导荧光成像病变细胞检测中,能够实现高质量的面阵图像,可提高系统性能,医生可根据所获取的荧光图像更方便更高效地进行检查和诊断[10]。选用新型超低噪声和高灵敏度面阵探测器MT9P006 CMOS探测器,有效分辨率为2 592 px×1 944 px,像元尺寸是22 μm×22 μm,12 bit分辨率,灵敏度176 V·(lx·s)-1,适合做荧光显微镜图像采集。 MT9P006传感器接口如图3所示,采用标准的视频采集接口,方便FPGA采集。FPGA将从MT9P006传感器采集到的图像数据经过FIFO后缓存到DDR2内存芯片中。 122万兆网通信 MT9P006传感器可以实现2 592 px×1 944 px分辨率下的16 Hz,也可以实现1 280×720分辨率下的60 Hz采集,最高数据率达到923 Mbit·s-1,在不压缩情况下,传统的USB20接口不能实现高帧率的传输,只能通过降低帧率实现传输。万兆以太网有10 Gbit·s-1网络带宽,具有传输延时低,传输距离远的特点,适合实时视频应用和图像的实时传递,实现探测器高分辨图像的高速传输。系统采用万兆以太网接口连接电脑端,将显微镜下观察到的图像传输到显示器,实现非压缩图像的快速、实时传输,并且可以通过客户端软件进行数据采集和参数设置。 系统的万兆网协议采用Xilinx公司的CoreGenerator中自带的Ten Gigabit Ethernet MAC IP核,IP核可极大地缩短开发周期和保证系统的稳定性[11]。IP核控制器用户端采用XGMII接口,15625 MHz差分时钟信号,在32 bit数据位宽下,理论数据率达到48 Gbit·s-1。与电脑的传输采用UDP方式,除去各种协议开销,实测图像传输速率达到18 Gbit·s-1,能够实现显微镜图像的实时传输。 123电机控制模块 采用半数字式对焦技术,代替传统显微镜手动对焦方法,实现物镜的自动对焦。自动对焦通常分为两大类:一类是测量镜头和被摄目标之间的距离;另一类是在焦平面上获得清晰成像的焦点。第一类自动调焦依赖于测量距离的方法,复杂度高、成本大且难以实现,通常第二类对焦技术广泛应用于显微镜的自动对焦[12]。采集到的图像由FPGA实现图像清晰度实时评价,通过评价函数实时调整电机,实现闭环控制,快速调焦。根据评价函数结果由FPGA驱动电机运动,带动物镜移动,从而获得对焦清晰的图像。在显微操作系统中,自动对焦对于后期的细胞识别以及操作精度,起着重要作用。 系统采用改进的自动聚焦算法。探测器采集病变细胞图像,在对焦开始时,先是粗调焦,采用较大的步长,让目标更快在焦平面的附近成像;在靠近焦平面时,采用细调焦,使得所成的图像更加清晰;实现摄像头的自动调焦[13]。调焦阶段采用Laplacian评价函数评价图像清晰度,获得评价函数最大值时,得到最佳清晰度图像。探测器从粗调焦阶段进入到细调焦阶段判断依据是探测器间隔移动相同的步长,获取多组粗调焦图片,计算其对焦评价函数的值,分析每组图像评价函数值的变化率,当变化率出现极大值时,探测器由粗调焦进入细调焦。 124图像清晰度评价函数 图像清晰度评价是显微镜自动对焦过程中的一个重要步骤,物镜从初始位置开始移动,利用评价函数计算清晰度,通过比较不同位置上图像清晰度值的大小,物镜向着能够增加清晰度的方向移动,最终移动到清晰度不再增加的位置上,这个位置就是具有最大清晰度的焦点。通过图像清晰度评价函数计算出在不同聚焦状态下图像的清晰度值,用来判断图像质量的好坏,图像的清晰度不高,则相应的图像就会比较模糊[14]。因此要选用实时性高,实用性强的基于图像梯度的清晰度评价函数。 2实验结果与分析 基于该系统设计,研制出针对人体癌细胞的便携式荧光成像设备,样机质量小于4 kg,功耗小于20 W。选用绿光作为照明光源,观察癌细胞获得荧光图像。在观察癌细胞过程中,探测器不断采集癌细胞荧光图像,根据图像清晰度评价函数计算荧光图像的清晰度值,移动镜头靠近焦平面,直到找到清晰度最高的图像。选择其中清晰度值变化比较明显的4张荧光图像作为一组,根据Tenengrad函数、Laplacian函数和方差函数3种图像清晰度评价函数分别计算荧光图像清晰度,荧光图像清晰度值如表1所示。 表13种评价函数下的图像清晰度值 Table 1Image sharpness value under 3 evaluation functions 评价函数图片1图片2图片3图片4Tenengrad函数1162 661802 382109 362192 40Laplacian函数1421 602081 262433 052525 99方差函数19086 4042092 4056976 4054088 90由表1可见,3种图像清晰度评价函数分别计算出4张荧光图片清晰度值的大小。从直观判断4张荧光图片清晰度不断增加,Tenengrad函数和Laplacian函数与直观判断一致,方差函数在判断图片3和图片4清晰度时出现失误,方差函数计算量小,但函数单调性较差。相比于Tenengrad函数,Laplacian函数精准性较好,在焦点附近变化较为明显,灵敏度较高。因此,本系统采用Laplacian函数作为图像清晰度评价算法。 系统采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)标本来观察癌细胞,FISH技术是一种非放射性原位杂交技术,广泛应用于生物学研究中,提高了基因定位的准确性。通过荧光显微镜观察杂交信号,FISH在荧光显微镜下确认出癌细胞所在的位置,并且对癌细胞做出定性、定位或相对定量的分析。荧光检测系统采用光谱滤光法,并且选用绿光、蓝光、紫光3个激发光源切换观察。 选择表1中的4张荧光图像作为一组,分别用绿光、蓝光、紫光作为照明光源,切换观察癌细胞获得清晰的荧光图像,对4张荧光图像计算Laplacian函数评价,图像清晰度评价函数值如表2所示。对应得到清晰度最高的荧光图像如图4所示。 表2Laplacian图像清晰度评价函数值 Table 2Laplacian image sharpness evaluation function value 光源图片1图片2图片3图片4绿光1421 601781 262433 052525 99蓝光0675 140802 151302 131447 33紫光0259 560301 420560 250696 25图4不同谱段癌细胞荧光图 Fig4Different spectrum of fluorescence emission from cancer cells 图4(a)~图(c)分别是在绿光、蓝光、紫光激发下看到的细胞荧光图像,图像清晰度值对应表2中的图片4。通过荧光发射不同频段下癌细胞的细节信息,能够看到目标荧光细胞的大小和位置区域,而且图像边界和细节部分清晰,分辨率达到10 nm。采用多波段LED光源,得到细胞多种波长荧光图像,相互对比观察,提高癌细胞识别的准确率。实验结果能满足对人体癌细胞检测的灵敏度和图像清晰度的要求。 3结论 选择LED光源,采用科学级超低噪声、超低暗电流、高灵敏的探测器,配合窄带滤光片、二向色镜,自动调焦时用Laplacian图像清晰度评价函数,采用万兆以太网传输图像,设计出荧光显微成像系统,并基于该系统,研制出针对人体癌细胞的便携式荧光成像设备,样机质量为4 kg,功耗小于20 W。实验表明,样机能够实现清晰的多谱段癌细胞荧光成像和快速检测,在降低噪声干扰、提高灵敏度、自动对焦、高速通信方式等方面都有较大改进。